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　　科研丨天大: 光敏乳酸乳球菌通过上转换光遗传学微纳米系统调控微生物-肠-脑轴(国人佳作)

　　本文开发了一种上转换光遗传学微纳米系统，以精确控制微生物疗法调节肠-脑轴。

　　肠-脑轴的发现已经证明，大脑功能会受到肠道微生物群代谢物的影响，因此探索新的工具来调节肠道微生物群从而对大脑功能发挥作用具有重要意义。同时，工程菌作为调节宿主健康稳态的口服生物活性治疗剂在微生物治疗中引起了广泛关注。然而，这种策略是否能够在体内远程调节宿主的大脑功能尚未得到研究。本研究中，我们设计了三种蓝光响应型益生菌作为口服活性生物治疗剂。它们由上转换光遗传学微纳米系统在时空上传递和控制。这种微纳米系统促进了外源性乳酸乳球菌在肠道内靶向和产生，实现了对焦虑行为、帕金森病和迷走神经传入等大脑功能的精准操控。这种无创和实时的益生菌干预策略使得从肠道到宿主的交流更加可控，这将使工程微生物能够准确有效地调节宿主的健康。

　　L. lactis NZ9000菌株已被普遍认为是一种安全的载体，并已在微生物治疗中用作口服剂。NZ9000的生长依赖于葡萄糖的添加，这通过在存在和不存在0.5%葡萄糖的基础培养基中的生长曲线a)。为了构建蓝光响应型乳酸乳球菌，我们使用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因，将蓝光响应性启动子pDawn引入乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148(图1a)。pDawn启动子由基于双组分系统YF1/FixJ的蓝光光传感器结构域组成，它控制阻遏物cI的表达，然后进一步调节由启动子PR驱动的GFP转录(图1b)。将重组质粒pNZ8148-GFP转化乳酸乳球菌菌株NZ9000(菌株LL-GFP)后，在黑暗条件下，GFP信号在基础水平沉默。在蓝光照射下，光照30 min后GFP强度增加了3倍，光照60 min后增加了6倍(图1c，d)。这些数据表明，工程化LL-GFP对外部蓝光照射具有快速且时间依赖性的响应。该菌株还显示出响应周期性外部蓝光的动态表达能力(图S1b)。由于乳酸乳球菌是通过口服输送到肠道的，它不可避免地会通过消化道，直接与消化液接触。这个过程会导致细菌降解，从而影响肠道乳酸乳球菌的最终数量。为了解决这个问题，最好将细菌包裹起来以防止胃降解并在肠道条件下提供靶向释放。据报道，海藻酸钠微球具有非常稳定的pH响应，并已广泛用于生物活性物质的封装和口服递送。海藻酸钠中-COO-和-COOH的电荷密度随环境pH值动态变化。由于海藻酸钠的pKa为3.4~4.4，当环境pH低于此范围时，-COO-获得质子转化为-COOH，形成固体水凝胶。当pH值升高时，-COO-之间的静电排斥力使水凝胶膨胀，导致水凝胶的破坏。此外，我们在海藻酸钠微球外加了壳聚糖壳，使微球更能粘附在肠壁上。为了帮助微系统更好地靶向小肠，将肠质子依赖性转运蛋白1(PepT1)抗体与壳聚糖混合(图1e)。通过各种跟踪剂对组分进行标记，我们可以观察到PepT1和壳聚糖位于微球的外壳中，而海藻酸钠和细菌分布在内核(图1f，g)。

　　(a) LL-GFP质粒构建示意图。(b) pDawn启动子在乳酸乳球菌中响应蓝光的示意图。(c) LL-GFP在蓝光照射下的GFP表达荧光图像。(d) c中GFP荧光强度的流式细胞术分析。(e) 海藻酸钠微球将乳酸乳球菌输送到小肠的示意图。(f)海藻酸钠微球壳聚糖层中PepT1的免疫荧光。(g)掺有各种染料的海藻酸钠微球的荧光图像。壳聚糖用DAPI(蓝色)染色。海藻酸钠用罗丹明(红色)染色，乳酸乳球菌稳定表达GFP(绿色)。

　　然后，评估海藻酸钠微球的pH响应。将微球浸入不同pH值的缓冲液中30 min，然后通过扫描电子显微镜(SEM)分析其形貌。结果表明，微球在pH 2时保持其原始直径，而在pH 8时体积膨胀(图2a)。这些结果与海藻酸钠的性质相对应。我们还证明，在通过pH 2缓冲液30 min期间，壳聚糖外壳仍然保持稳定(图S1c)。接下来，我们将乳酸乳球菌(具有氯霉素抗性)封装到微球中。在各种pH缓冲液中浸泡30 min后，将剩余的微球用氯霉素包被在M17固体培养基上。从图2b中可以看出，当用碱性缓冲液处理时，乳酸乳球菌菌落分布在微球周围。然后，首先将包裹乳酸乳球菌的微球浸入酸性缓冲液中30 min，然后转移到碱性缓冲液中30 min。将每种缓冲液的上清液涂抹在M17固体培养基上。如图2c所示，乳酸乳球菌没有释放到酸性缓冲液中，而乳酸乳球菌大量释放到碱性缓冲液中。此外，我们还检测了微球壳中的PepT1抗体是否会影响其pH响应性。结果表明，PepT1抗体不影响碱性缓冲液中的细菌释放(图2d)。这些结果表明微球对肠道pH具有良好的响应性。

　　之后，我们将传统的口服管饲法与微球将乳酸乳球菌输送到小肠进行了比较。为了实现这一点，乳酸乳球菌被CFSE-DA标记为绿色荧光，通过传统的口服管饲法或微球传递给小鼠。然后通过流式细胞术计算肠道中的细菌。高荧光基团代表外源性乳酸乳球菌。结果表明，与传统灌胃组相比，微球处理组回肠中乳酸乳球菌增加了～4倍，结肠中乳酸乳球菌减少了～1.46倍，空肠无明显变化(图2e，f)。这些数据表明，在用微球处理后，外源性乳酸乳球菌更倾向于在小肠中定殖。然后我们分析了小肠中的外源细菌数量。取小肠内容物，经灌胃或微球给药后，采用菌落法定量乳酸乳球菌(图S1d)。这些数据表明，这两种方法都不能保证乳酸乳球菌的永久定殖，这与外源性细菌很难与共生肠道微生物群竞争的事实相一致。然而，微球可以帮助乳酸乳球菌停留更长时间。然后，我们用各种染料标记微球中的成分，以追踪它们在肠道中的分布。与上述结果一致，我们观察到接受PepT1微球的小鼠回肠中海藻酸钠沉积显著更高(1.3倍)，而结肠中海藻酸钠沉积显著降低(0.8倍)(图2g)。总体而言，这些结果表明，用PepT1将乳酸乳球菌包裹在微球中可以增强乳酸乳球菌向小肠的靶向输送。

　　(a)海藻酸钠微球在各种pH缓冲液下的扫描电子显微镜(SEM)结果。将海藻酸钠微球浸入酸性pH缓冲液(pH=2)或碱性缓冲液(pH=8)中30 min。(b)海藻酸钠微球在酸性缓冲液(pH=2)或碱性缓冲液(pH=8)中释放乳酸乳球菌。(c)海藻酸钠微球体外释放乳酸乳球菌，模拟体内消化道的pH值。(d)海藻酸钠微球中乳酸乳球菌的释放响应于各种pH值。在两组pH=8中P=0.0315。(e) CFSE-DA的流式细胞仪谱标记了海藻酸钠微球的乳酸乳球菌和传统的口服管饲法。(f) e的统计分析。通过双尾Students-t检验确定统计显著性(空肠P=0.23；回肠**P=0.0021；结肠*P=0.0047)。数据代表每种条件下三只小鼠的平均值和标准偏差。(g)小鼠空肠、回肠和结肠肠段中海藻酸钠微球(有或没有PepT1)分布的荧光可视化。肠细胞用DAPI(蓝色)染色。海藻酸钠微球的壳聚糖用钙黄绿素(绿色)染色，海藻酸钠核用罗丹明(红色)染色。白色虚线表示肠的ektexine。放大图像显示回肠中PepT1组的细节。统计显著性由双尾Students-t检验确定(回肠**P=4.87×10-5；结肠**P=3.36×10-5)。数据代表三个重复的平均值和标准偏差。

　　如何将可见光传递到体内深部肠腔以帮助对光敏感的乳酸乳球菌感知光是另一个问题。传统方法在肠道附近植入光纤，这通常会导致不可逆的组织损伤。或者，稀土上转换材料可以将长波长NIR光转换为短波长可见光。由于已知长波长光比可见光具有更强的组织穿透能力，上转换材料特别适用于深部组织应用，已广泛与传统光遗传学操作相结合，用于许多生物学调控。在这种思想的指导下，我们尝试使用上转换光遗传学来调节深层组织的细菌活性。已成功合成了长度约1.5 μm的铥(Tm)上转换棒状上转换材料(UCR)，其在980 nm光的激发下发出475 nm蓝光(图3a、b和图S2a)。UCR由无机元素组成，对活细胞有严重的毒性。在体内应用时，我们需要考虑材料如何安全地在动物身上发挥作用。为了解决这个问题，在紫外光固化后，使用光聚合微粒将UCR封装到PEGDA水凝胶中，形成上转换微滴(UCM)。UCM的直径约为150 μm(图3c和图S2b，c)。这种圆形微粒有望通过口服给药输送到肠道。

　　然后，对UCM的安全性进行了调查。由于UCM内部的紧密交联，微粒在浸入模拟肠道缓冲液后至少保持稳定30天(图S3a)。使用吲哚菁绿(ICG)作为指示剂，将ICG封装的UCM(UCM-ICG)浸入各种缓冲液中，并且没有ICG从UCM泄漏到上清液(图S3b)。在近红外光照射60 min后，UCM也没有ICG泄漏(图S3c)。这一特性保证了UCM在肠道环境中的pH值和光稳定性。接下来，我们测试了UCM与NIR光照是否可以在体外培养的LL-GFP中诱导GFP表达。UCM与LL-GFP共培养，NIR光(2 mw/mm2)在培养底部外照射。不同光照时间下GFP的表达与蓝光诱导效应具有相似的趋势(图3d)。这些结果表明UCM和NIR光处理能够诱导LL-GFP中的基因表达。值得注意的是，该系统还表现出荧光信号的可逆性，以响应以2 h间隔循环的980 nm激光照射(图S4a)。细菌生长曲线还显示蓝光和近红外光对细菌生长无明显影响(图S4b)。

　　为了探索灌胃后光照的优化时间，我们使用体内成像来跟踪UCM在消化道的移动路径。通过追踪UCM-ICG，我们发现灌胃后3～4 h，UCM在小肠内聚集的含量最多，20 h后微粒可随粪便排出体外(图3e和图3e)。考虑到频繁治疗对小鼠的副作用，我们将灌胃后4 h作为光照的最后时间点。此外，管饲后没有物质泄漏到其他器官(图S5b)。这些数据表明UCM在小鼠肠道中具有良好的稳定性和安全性。肠道中的病理学结果还表明，接受UCM+NIR光处理的小鼠未显示出可观察到的组织损伤(图S6a-d)。这些评估表明UCM的生物相容性和生物安全性。另外，体内成像显示了细菌(以表达luxABCDE的大肠杆菌为代表)和UCM-ICG(图S6e)的共定位，支持了该系统在体内应用的可行性。

　　最后，我们测试了该系统是否可以在小鼠肠道中诱导GFP表达。为此，小鼠肠道预先用LL-GFP定殖，然后通过口服管饲法将UCM输送到肠道。4 h后NIR光照射剃毛小鼠的腹部。NIR照射30 min后，取出肠道内容物进行GFP分析。从图3f和图S6f可以看出，在空肠和回肠，与暗处理组相比，UCM和NIR光处理组可以观察到明显的荧光峰。此外，在部分小肠段中，近红外光和蓝光处理组的GFP表九游娱乐官方平台达相当。考虑到可见光对宿主的副作用以及可植入光纤到组织的缺点，我们使用上转换光遗传学纳米系统作为替代光源。

　　(a) UCR的扫描电子显微镜(SEM)。(b) 980 nm激光激发蓝色发光UCR的发射光谱。(c)使用明场和荧光显微镜对UCM进行可视化。(d) FACS点图表示UCM+NIR光或UCM+蓝光照射下的GFP荧光。(e)在不同时间点后用UCM-ICG治疗的小鼠的体内成像。(f) FACS点图表示用UCM+NIR光或UCM+蓝光处理30 min的小鼠肠道内容物中的LL-GFP表达。每个实验至少重复3次，结果相似。

　　据报道，口服GABA可以缓解小鼠的焦虑样行为。为了使用基于微生物的肠-脑轴调节来实现对焦虑的精确调节，乳酸乳球菌被设计为在光照下产生GABA。我们首先编译了一种分泌GABA的乳酸乳球菌菌株(LL-GABA)，该菌株在NIR光和UCM触发条件下产生GABA以实现GABA的时空表达。两个对GABA产生至关重要的基因被插入到pDawn启动子的下游：催化从谷氨酸(Glu)转化为细胞内GABA的谷氨酸脱羧酶gadb和将GABA运输出细胞的Glu-GABA反转运蛋白gadc (图4a)。LL-GABA显示出对上转换光遗传学纳米系统的时空响应，随着近红外照明时间的延长而增加(图4b)。为了验证培养基中GABA积累的产生是由于gadb和gadc基因，我们设计了另一种不能产生GABA的菌株(LL-ΔGABA，gadb基因中有碱基缺失)。结果表明，菌株LL-ΔGABA在上转换光遗传学纳米系统中没有产生GABA的趋势(图4c)。由于GABA已被证明可促进乳酸乳球菌的耐酸性，我们随后评估了LL-GABA在UCM+NIR光处理后的耐酸性。与野生型NZ9000相比，GABA帮助LL-GABA更好地适应酸性环境(图S7a)。该结果证明了产生的GABA的生物活性。然后，我们旨在证明肠道中LL-GABA的光遗传学调控比传统的口服灌胃方法具有更好的精确度。为了实现这一点，一组小鼠口服GABA标准(10 mg/kg)。对于另一组，首先用菌株LL-GABA定殖小鼠，然后给予小鼠UCM+NIR光连续60 min。每15 min抽取各组血清进行GABA含量分析。细菌产生的GABA和口服GABA的体内比较表明，上转换光遗传纳米系统在光照下更可控，因为血清中GABA含量在NIR光撤出后下降，而口服GABA呈现持续增加的趋势(图S7)。这些结果表明，这种光触发方法可以精确控制小鼠体内GABA的产生。

　　在使用工程光响应细菌作为抗焦虑口服活性生物治疗剂之前，我们首先分析了定殖后的肠道微生物组。如图4d所示，灌胃LL-GABA 10天后，粪便微生物中细菌类群的丰度在对照组和定殖组之间没有变化。16S rRNA基因序列的数据集显示，在LL-GABA定殖小鼠中，乳杆菌的相对丰度显著增加。该证据表明重建的LL-GABA已成功在小鼠肠道中定殖。然后，我们测试了GABA在缓解小鼠焦虑行为方面的作用。高架十字迷宫(EPM)和旷场测试(OPT)是验证焦虑行为的两种常用方法。我们可以从图S8a-f中看出，缓解焦虑行为依赖于剂量依赖性GABA。接受最低浓度标准GABA(1 mg/kg)或NIR照射时间(5 min)的小鼠在EPM和OPT测试中均未表现出焦虑缓解症状。这些数据表明，小鼠焦虑行为的缓解依赖于GABA浓度。对于上转换光遗传学治疗，60 min的近红外光照射足以缓解焦虑行为。为了证明最终效果是由UCM和NIR光诱导的，我们设置了几个对照组以排除其他因素。在检测的第一天，在EPM中，从进入率和张开臂停留时间的指数，我们得出结论，与焦虑模型组的小鼠相比，UCM+NIR光治疗的小鼠更倾向于留在张开臂(图4e-g和图S8g)。类似地，在OPT中，同一组小鼠(UCM+NIR)在区域之间表现出进入次数增加，尽管中心时间和总移动距离没有显示出显著变化(图4h-j和图S8h)。这些数据表明，UCM+NIR光处理的焦虑模型小鼠具有主动移动的倾向，这代表了缓解的焦虑行为。

　　为了全面评估GABA通过肠-脑轴缓解小鼠焦虑行为的作用，我们测试了大脑中一些与焦虑相关的生理指标。由于大脑炎症反应已被证明与焦虑密切相关，我们发现，与焦虑模型小鼠相比，UCM+NIR-光治疗组的某些炎症因子均降低，尤其是IL-6和TNF-α (图4k-m)。此外，已知大脑中的GABA受体(GABAR)蛋白水平会对焦虑行为作出反应。我们发现，与焦虑模型组相比，UCM+NIR光处理组中GABAR蛋白水平上调了2倍(图S9a)。这些结果支持使用工程肠道细菌影响大脑的想法。此外，我们还发现LL-GABA在定殖后30天仍保留在粪便中，即使它的功能已经丧失(图S9b，c)。这些结果表明，这种工程化的基于益生菌的治疗策略存在一些时间限制。我们还在治疗后的第二天记录了这种方法在行为水平上的持续效果，呈现出放缓趋势，表明一次性光刺激对缓解焦虑的作用非常短暂(图S10)。对于长期调节，可能需要频繁的UCM和NIR光刺激。

　　帕金森病(PD)是最常见的神经退行性疾病之一。我们引入了粒细胞集落刺激因子(GCSF)，这是一种CNS的有效生长因子，已被证明在PD恢复中的神经保护和神经功能恢复中发挥作用。首先，我们通过克隆pDawn模块下游的乳杆菌信号肽usp45和mus GCSF基因构建了NIR光响应型GCSF分泌乳酸乳球菌(LL-GCSF)菌株(图5a)。在体外和体内，UCM+NIR光照后GCSF的分泌与光照时间呈正相关(图5b，c)。通过将Flag标签与GCSF(LL-GCSF-Flag菌株)融合，可以跟踪肠道益生菌产生的GCSF的运输。在近红外光照射60 min后，肠道产生的GCSF-Flag可以到达大脑(图S11a-d)。然后，我们评估了GCSF的生物活性，它已被证明可以促进肿瘤生长。将LL-GCSF上清液与4T1肿瘤细胞共培养，采用CCK-8法检测细胞增殖情况。结果表明，UCM+NIR光诱导的GCSF可以促进肿瘤细胞的生长(图S11e)。这些数据表明，细菌产生的GCSF具有生物活性。

　　由于认知障碍被认为是PD最典型的症状之一，我们使用PD动物模型，用Y迷宫测试结果。PD模型小鼠用微球包裹的LL-GCSF治疗10天。再过7天，在UCM给药后4 h，对小鼠腹部施加NIR光照明。在训练阶段，新区域关闭，记忆区域打开。将小鼠置于起始区域进入迷宫，然后自由探索Y迷宫3 min。1 h后，在记忆阶段，所有区域都被打开，在记忆区域花费时间越长的小鼠被认为空间认知能力越强(图S12a)。对相同的小鼠进行连续3天的测试，第9天再次接受5天UCM+近红外光照射后再次测试。在测试的第一天和第二天(第1天和第2天)，小鼠表现出进入记忆臂的明显趋势。然而，这一趋势在晚些时候(第3天)减弱，表明这种微生物疗法的疗效具有时效性。经过第二期UCM+NIR光治疗5天(第4天至第8天)后，趋势在第9天恢复，表明该治疗策略需要长期NIR照明才能获得稳定的治疗效果(图5e、f和图S12b，c)。PD的另一个指标是大脑急性炎症反应症状。这是由于α-突触核蛋白(αSyn)的聚集，激活了大脑驻留的小胶质细胞并导致中枢神经系统炎症反应，抑制了酪氨酸羟化酶(TH)的表达，导致多巴胺合成减少并导致PD。小鼠大脑中αSyn、TH、AIF1、IL-2、IL-6和TNF-α的测量结果表明，与未处理的对照小鼠相比，PD小鼠的αSyn和炎症标志物蛋白水平下降，而TH水平下降；在移植了LL-GCSF并用UCM+NIR光处理的小鼠中，对αSyn、AIF1和IL-6的影响显著逆转(图5g、h和图S13)。

　　为了评估LL-GCSF产生的GCSF对光照对脑基因转录的影响，分析了来自未处理的PD模型小鼠和UCM+NIR光处理的小鼠的脑组织。在用UCM+NIR光处理后，小鼠显示约228个基因发生改变，包括主要与神经活性配体-受体相互作用相关的关键基因(图5g-i)。例如，最重要的下调基因之一，内皮素B型受体(Ednrb)，可能作用于ERK1/2通路，因此可能介导多巴胺能神经元的氧化损伤机制。内皮生长因子受体EGFR信号传导已被证明在神经发生、神经元存活和维持中起作用。同样，蛋白激酶Cα(Prkca)是EGFR信号家族的成员之一，在UCM+NIR光组中上调。此外，观察到属水平的乳杆菌丰度增加，定殖后至少保留30天(图S14)。这些结果表明，肠道中微生物产生的GCSF干预了PD症状，并最终改变了大脑中PD相关基因的水平。因此，LL-GCSF在NIR光照射下产生GCSF，然后以光依赖性方式缓解宿主的PD症状。

　　(a)将乳酸乳球菌中负责蛋白质分泌的特定信号肽usp45序列融合的GCSF基因序列引入pDawn模块。(b) LL-GCSF在体外UCM+NIR照射30和60 min后分泌的GCSF。(c，d) LL-GCSF小鼠UCM+NIR光照30和60 min后血清(c)和大脑(d)中的GCSF含量。(e，f)空间认知能力的Y迷宫测试(n=6只小鼠)。相同的小鼠接受了连续3天的行为测试。在第一轮行为测试后，这些小鼠接受了另外5天的UCM+NIR光照(每天60 min)，并在第9天在Y迷宫中重新测试。MPTP和UCM+NIR组之间的统计显著性由双尾Students-t检验。数据代表平均值和标准偏差。(g,h)经各种处理的小鼠脑提取物中的TH、αSyn和AIF1蛋白含量。MPTP和UCM+NIR组之间的统计显著性由双尾Students-t检验确定(αSyn中**P=0.006；AIF1中**P=0.0013)。数据代表三个生物学重复的平均值和标准偏差。(i) MPTP(PD模型)与UCM+NIR光处理小鼠(n=3)之间大脑中基因表达的差异。突出显示在UCM+NIR光处理后基因下调(绿色)或上调(粉红色)。(j) i中代表性显著改变基因的KEGG通路分析。Con：未经任何处理的小鼠。MPTP：未经任何处理的PD模型小鼠。

　　6 NIR光响应型GLP1分泌L. lactis通过直接迷走神经刺激大脑神经元

　　到目前为止，结果表明，近红外光响应型重组乳酸乳球菌可用于缓解焦虑和PD症状，并具有长期效果。然后，我们测试了该模型是否也可用于通过短期刺激迷走神经来影响大脑。由于迷走神经受到肠道中存在的许多因素的调节，这提供了一条信号通路，允许大脑受到肠道细菌刺激物的调节。例如，GLP1由肠内分泌细胞产生并作用于肠神经系统(ENS)中的GLP1受体，之后ENS释放神经元一氧化氮合酶(nNOS)，促使一氧化氮直接刺激迷走神经，最终影响中枢神经系统的神经元活动。因此，我们测试了该系统是否可以通过GLP1介导的迷走神经刺激来影响大脑中的神经元活动。通过在pDawn模块的控制下克隆usp45和GLP1构建了NIR光响应型GLP1分泌乳酸乳球菌(LL-GLP1)(图6a)。由于GLP1是一种在生理条件下容易降解的短肽(t1/2≈1-2 min)，因此我们融合了一个His标签，使其更容易检测(即LL-GLP1-His)。光照后，LL-GLP1-His在体外和血清中均产生GLP1(图6b-d和图S15a、b)。此外，据报道GLP1可促进ins-1细胞的增殖。使用CCK-8测定法证实了这种效果(图S15b)。

　　接下来，我们探讨了LL-GLP1对肠道和大脑之间神经连接的影响。为此，使用早期研究中使用的Cre介导的单突触反向病毒追踪系统追踪肠神经系统和迷走神经。在十二指肠黏膜下穿刺注射AAVrg-hSyn-Cre-mCherry，在双侧结节神经节注射AAV2-Ef1α-DIO-EYFP后，mCherry和EYFP在脑干孤束核(NTS)中的重叠表达表明来自迷走神经的传入神经末梢(图S15d，e)。这与迷走神经信息首先在NTS中接收的事实是一致的。根据这一结果，小鼠用LL-GLP1治疗10天。然后，通过管饲法给予小鼠UCM并暴露于NIR光30 min。结果，暴露于近红外光导致NTS左侧和右侧的c-Fos阳性神经元增加约2.5倍，表明NTS中兴奋神经元数量增加，这是由于刺激迷走神经上产生GLP1的肠道微生物引起的(图6e，f)。为了证实迷走神经的刺激是导致这种传导的原因，在结节神经节的右侧或左侧被切断(穿过颈动脉)的小鼠身上进行了相同的实验，并比较了左侧和右侧NTS中c-Fos阳性细胞的数量。在UCM+NIR光处理后30 min，与LL-GLP1移植小鼠的完整迷走神经支配的NTS侧相比，在切断的迷走神经支配的NTS侧观察到c-Fos阳性细胞数量显著减少0.8倍（图6g，i）。

　　为了进一步证实UCM+NIR光处理后LL-GLP1产生GLP1会导致大脑刺激，我们进行了体内电生理记录以监测NTS神经元活动的峰值变化。在经过UCM和NIR光照射30 min处理的LL-GLP1移植小鼠中，峰值频率增加(图6j，k和图S15c)。作为对照，在UCM+NIR光处理的LL-GABA移植小鼠中检查迷走神经的活动，正如预期的那样，在NTS两侧均未检测到明显的c-Fos阳性信号(图S15f)。综上所述，在用UCM和NIR照射30 min后，肠道中LL-GLP1表达的GLP1刺激了NTS中的神经元，这表明该策略可用于通过外周神经系统操纵CNS，具有短期效应。

　　图6. NIR光响应型GLP1分泌乳球菌通过直接迷走神经刺激大脑神经元。

　　本文开发了一种上转换光遗传学微纳米系统，以精确控制微生物疗法调节肠-脑轴。阻碍微生物疗法发展的一个困难是外源微生物需要频繁给药，因为它们在肠道中的停留时间是有限的。虽然海藻酸钠微球已经实现了乳酸乳球菌在小肠的高效递送，但该菌株在肠道内的定殖期持续1个月，但其对光的反应性会随着时间的推移而下降。这可能是由于细菌菌落检测到的外源性益生菌急剧减少所致。基于这些观察结果，还需要探索一种长期的肠道定殖策略，从而减少重复给药。还有一点需要注意的是，上转换光遗传学纳米系统虽然实现了体内时空调控，但也存在一些不足。例如，UCM需要在每次光照前对小鼠进行口服灌胃。通过将照明材料包裹在肠道内定殖或直接设计一些不需要照明材料作为介质的近红外响应光促进剂，有望避免这种缺陷。

　　总之，我们创建了一个微纳米平台，用于肠道中工程益生菌的时空调控。我们展示了该系统如何调节大脑功能。未来的研究还将确定使用该系统是否可以实现控制肠道和其他远端器官之间的连接。例如，除了肠-脑轴外，心脏、皮肤和肾脏等器官也被证明与肠道密切相关。总体而言，我们的工作创建了一个平台，使用上转换光遗传学微纳米系统来控制肠道中工程益生菌的递送和表达，这可能使工程微生物能够准确有效地调节宿主的健康。结合纳米技术和基因工程的进步，该策略可能会解决现有的局限性，促进微生物疗法的临床应用。