(武汉光电国家实验室(筹) Britton Chance 生物医学光子学研究中心，华中科技大学生命科学与技术学院，武汉 430074)
摘要 神经活动即神经兴奋的产生与传递，阐明神经活动的基本过程是现代脑科学的目标之一． 神经活动的光控制用光作为 激活和抑制神经活动的手段，主要通过笼锁化合物、光敏感蛋白、光开关蛋白等物质的光活化或直接光刺激来实现． 光控制 神经活动的方法具有操作简单、非接触、高时空分辨、可定量重复等优势，因此在基础和临床神经生物学研究中具有广阔的 应用前景． 综述了各种光控制神经活动方法的原理、特点及最新进展，分析了其技术发展的趋势．
大脑是一个复杂的多级系统，大致可分为分 子、突触、神经元、神经回路、投射区和系统等不 同层次，大脑功能是由各神经细胞功能逐级整合而 成． 在研究神经细胞如何完成各种功能时，往往需 要激活或抑制特定细胞以确认其在神经回路中的作 用[1]，因此，神经活动的活化和抑制是神经科学研 究中不可或缺的技术手段．
目前神经活动的控制主要通过电刺激和神经药 理学方法等实现． 电刺激方法通过向细胞内注入电 流或在细胞外给予场电势来激活神经活动． 虽然该 方法时间精度非常高，但是细胞内注入电流会对被 刺激细胞产生不可逆的损伤，并且难以实现多个细 胞或多个部位的同时刺激，而细胞外场电势刺激方 法的细胞特异性和空间精度很低． 神经药理学方法 通过兴奋性或抑制性神经递质等来激活或抑制神经 活动． 由于受加药方式和药物扩散等影响，该方法 的时间和空间精度、细胞特异性不高． 尤其是在厚 组织或活体实验中，药物难以精确作用于特定部位 调控特定细胞的活动．
用光作为调控手段是一种研究神经活动的新方 法． 1971 年，Fork[2]用 488 nm 激光照射海兔神经 节细胞时记录到细胞的动作电位，于是提出了这一 开创性的方法． 近年来，随着各种光活性物质的合 成和光学技术的发展，很多研究小组对光控制方法 进行了改进并初步应用于神经生物学领域． 通过光 活性物质控制神经活动只需要特定光束扫描预选的
活化位点，实验操作非常简单． 结合荧光标记及成 像技术，可以同时记录所调控神经细胞的形态、位 置信息以及功能信号，易于同时确定该细胞在神经 网络中的结构定位和功能，因此具有广阔的应用前 景． 斯坦福大学的 Zhang 和 Wang 等[3]2007 年发表 在《自然》(Nature)上关于光控制神经回路的文章， 被该杂志评为该年度最受欢迎的论文之一，并被麻 省理工学院技术综述评为该年度十大最有影响的技 术之一． 本文对光控制神经活动方法的原理、特点 与最新应用进行综述，并提出神经活动研究对光控 制技术的新要求，分析光控制技术的发展趋势．
神经活动的光控制即通过光活性物质的光活化 实现激活和抑制神经活动的目的． 根据所使用光活 性物质的特性，将光控制方法分为 4 类，分别为： a． 笼锁化合物的光解笼锁． 对笼锁化合物光活化 解笼锁，将其从封闭状态转变为活性状态调控神经 活动[4]． b． 光活化光敏感蛋白． 激活表达于神经 细胞膜上的光敏感蛋白质，如视紫质通道，诱导细
胞膜电位的去极化或超极化[5]． c． 光活化光开关蛋 白． 光照连有光致异构的化学基团的通道，打开或 关闭该通道，调控神经活动[6]． d． 激光直接刺激. 激光直接刺激诱导神经元产生神经活动[7]． 1援1 光解笼锁
笼锁化合物是一类功能被屏蔽的生物活性分 子，其全称为光致不稳定笼锁化合物． 该物质一旦 吸收特定波长的光子，分子结构就发生改变，释放 出活性分子，这一光活化过程称为光解笼锁． 笼锁 九游官网化合物的种类很多，主要包括第二信使、核苷酸、 神经递质、钙离子等． 一种理想的笼锁神经递质具 备以下特性：a． 具有热稳定性，尤其不能水解； b． 光解释放快速高效，能满足突触事件对递质释 放的时间 (ms) 和浓度 (滋mol/L) 需求；c． 笼锁物 质、反应中间产物以及光分解的副产物均应完全惰 性，且对递质的受体、转运体和释放的递质代谢等 没有影响．
MNI-Glu 的活化光谱范围为 300～ 380 nm，最 大活化波长约为 355 nm． 实验通常采用紫外激光 或氙灯配合适当的滤光片进行光解笼锁[8]． 光活化 释放活性谷氨酸的量取决于激发光的强度、激发体 积以及笼锁谷氨酸的浓度等． 该方法空间精度取决 于光源类型、激发光的波长、物镜倍数及数值孔径 等，时间精度依赖于激发光的波长、强度以及系统 的光束控制能力等． MNI-Glu 的光活化过程如下式 所示：
光解笼锁释放的活性谷氨酸可与各种谷氨酸受 体结合引起细胞响应，如图 1 所示，MNI-Glu 光解 笼锁释放的谷氨酸激活神经元树突上的谷氨酸受体
引起神经活动． MNI-Glu 满足上述理想笼锁神经递 质的所有必要条件[4]． 首先，MNI-Glu 的热稳定性 好，在生理 pH 下几乎不发生水解，即使在 pH 值 为 12 和温度为 30℃ 环境下其半衰期仍大于 6 h． 其次，MNI-Glu 光分解速度大于 3 000 s-1，在氙灯 闪烁光分解中， AMPA 受体(琢-amino-3-hydroxy-5methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor，谷氨酸受 体的一种)介导电流的上升时间小于 1 ms． 此外， MNI-Glu、光分解副产物对谷氨酸受体没有拮抗和 激动作用，而且光解笼锁释放的谷氨酸介导的电流 与内源性谷氨酸介导的电流形状完全一致．
ChR2 是 从 单 细 胞 绿 色 藻 类 Chlamydomonas reinhardtii 上分离 出来的一种感光性蛋 白质． 其 N 端的 315 个氨基酸残基高度保守，组成 7 个跨 膜螺旋构成了一个光门控的阳离子通道． ChR2 的 光活化光谱在 350～ 550 nm 范围内(中心波长为 470 nm)． 表达 ChR2 的细胞在此波段的光照下， ChR2 通道打开，Na，Ca2 等进入胞内，产生一内 向电流，引起细胞去极化产生动作电位． ChR2 的 响应速度非常快，光刺激后 50 滋s 内即记录到光介 导的电流[9]． 2005 年，Boyden 等[5]将 ChR2 表达于 哺乳动物神经元的细胞膜上，用于神经活动的光 活化．
NpHR 是 从 一 种 嗜 盐 古 细 菌 Natronomonas pharaonis 上分离出来的光驱动氯泵，其分子结构 与 ChR2 类 似 ， 包 含 一 个 7 次 跨 膜 螺 旋 结 构 ． NpHR 的光活化光谱为 525～ 650 nm(中心波长为 578 nm)． 表达 NpHR 的哺乳动物细胞在该波段光 照射下启动氯泵，胞内氯离子浓度增高产生超极化 反应． 光照射表达 NpHR 的细胞引起的光电流出 现和消失的时间分别为 68 ms 和 73 ms． 2007 年， 斯坦福大学的 Zhang 等[3]和麻省理工大学 Han 等[10] 同时将 NpHR 表达于神经元上，用于神经活动的 光抑制． 由于 ChR2 和 NpHR 的光活化谱较少重 叠，如图 2 所示，这两种蛋白质被联合用于双向控 制神经活动 ． [10] ChR2/NpHR 体系的时间精度依赖 于系统对光束的控制能力以及激发波长和强度等， 而空间精度则与刺激九游官网光的波长、光激发体积以及该
图 2 光活化光敏感蛋白调控神经活动 : 表达 ChR2 的神经元; : 表达 NpHR的神经元;
此外，Rhodopsin 4(RO4)是另外一种被用于抑 制神经活动的光敏感蛋白． 将该蛋白质与 G- 蛋白 偶联，当波长 355 nm 的光照表达 RO4 蛋白的细胞 时，产生 G- 蛋白偶联的抑制效应[11]． 由于光电流 出现和消失的时间延迟较长，即电流出现时刻较光 照开始时刻延长约 300 ms，电流消失时刻较光照 停止时刻延迟约 6 s[11]，因此 RO4 应用较少． 1援3 光开关蛋白
光开关蛋白(light-switchable protein)是一类连 接有偶氮苯基团(azobenzene)的离子通道或者受体. 偶氮苯基团具有光致异构效应，500 nm/380 nm 波 长的光照射下，会发生顺式(臂长约 1 nm)和反式 (臂长约 1.7 nm)之间异构转化，即基团臂长发生改 变[6]． 将偶氮苯基团与受体或离体通道的功能域
共价结合，即可通过光照射改变基团的臂长来控制 光开关蛋白中配体与受体的结合与解离或者通道 的开放与关闭． 偶氮苯基团光致异构效应如下式 所示：
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